Euroflow: een onafhankelijk wetenschappelijk samenwerkingsverband van 10 ... - Essay Marketplace

Euroflow: een onafhankelijk wetenschappelijk samenwerkingsverband van 10 …

Euroflow: een onafhankelijk wetenschappelijk samenwerkingsverband van 10 diagnostische onderzoekscentra, opgericht in 2005. Streven naar innovatie en standaardisatie binnen de flowcytometrie en immunofenotypering van patientmonsters. Het belangrijkste doel van het EuroFlow consortium is internationale samenwerking voor verbeteringen in de diagnostiek en behandeling van patienten met hematologische maligniteiten.

Doelen EuroFlow in 2012[1]:
‘ Ontwikkeling en evaluatie van nieuwe antistoffen
‘ Ontwikkeling van nieuwe immunobead assay technologie
‘ Ontwikkeling van nieuwe software tools gevolgd door nieuwe analyse methoden voor het herkennen van complexe immunofenotypische patronen
‘ Ontwerpen van nieuwe protocollen en standard operating procedures (SOP’s)
‘ Ontwikkeling en standaardisatie van snelle, nauwkeurige en zeer sensitieve flowcytometry
EuroFlow heeft meerdere 8 kleuren antistof panels samengesteld die worden gebruikt voor de classificatie en diagnose van leukemie en lymfomen. Deze panels worden met succes gebruikt in de aangesloten laboratoria. In samenwerking met BD Biosciences wordt er nu gewerkt aan het uitbrengen van buizen met deze antistoffen in een gevriesdroogde vorm. Deze buizen worden op de markt gebracht in combinatie met de bij behorende reagentia en softwarepakketten. Tot nu toe is alleen de LST buis commercieel verkrijgbaar, de rest volgt nog. Voor mijn project zal ik gebruik gaan maken van prototype buizen waarvan de antistof samenstelling nog niet definitief is.
Achtergrond buizen
ALOT: Acute leukemie ori”ntatie tube.
Ontworpen om bij aanwezigheid van blasten de oorsprong te achterhalen waarna de aandoening geclassificeerd kan worden. Snelle en effici”nte analyse van een monster.
Wordt gebruikt voor de diagnose van BCP-ALL, T-ALL en AML.
Klonale groei van onrijpe hematologische voorlopercellen.
Markers:
CD45 Leukocyten
CD34 vaak expressie bij acute leukemie
CyMPO zeer specifieke myeloide marker
CyCD3 specifieke T-celmarker
smCD3 specifieke T-celmarker (CyCD3+, smCD3- bij T-ALL)
CD19 zeer sensitieve B-celmarker
CyCD79a B-cellijn
CD7 positief bij (bijna) alle T-ALL en bij CyMPO neg AML
LST: lymfoide screening tube
Diagnose en classificatie van lymfoide maligniteiten. Eerste gevriesdroogde buis.
Scheiding tussen normale (reactieve/polyklonale) cellen en abnormale (klonale/aberrante) cellen.
Markers:
CD45 Leukocyten, rijpe vs onrijpe lymfocyten
CD3 T-cellen
CD19 B-cellen
CD20 B-cellen
CD56 NK-cellen
SmIg” B-cellen deels
SmIg” B-cellen deels
CD4 T-cellen T-helpercellen
CD8 T-cellen, cytotoxische T-cellen
CD5 T-cellen. T cells express higher levels of CD5 than B cells. CD5 is upregulated
on T cells upon strong activation.
CD38 normale vs abnormale lymfocyten
TCR” T-cellen deels
B-CLPD T1: B-cell chronic lymphoproliferative diseases, tube 1
Vervolgbuis na de LST buis bij aanwezigheid van een klonale B-cel populatie. Diagnose CLL. Rijpe perifere B-cel maligniteiten. Als er vooraf een hoge verdenking is van de diagnose B-CLPD wordt er aangeraden de LST en de B-CLPD Tube 1 gelijktijdig in te zetten om tijd en geld te besparen.
Markers:
CD19 B-cellen
CD20 B-cellen
CD45 leukocyten
CD23 It is found on mature B cells, activated macrophages, eosinophils, follicular
dendritic cells, and platelets. In flow cytometry, CD23 is helpful in the
differentiation of chronic lymphocytic leukemia (CD23-positive) from mantle cell
leukemia (CD23-negative)
CD10 common acute lymphocytic leukemia antigen. This protein is present on leukemic
cells of pre-B phenotype, which represent 85% of cases of ALL
CD79b is associated with agammaglobulinemia-6
CD200 this gene may regulate myeloid cell activity and delivers an inhibitory signal for
the macrophage lineage
CD43 it may be useful as part of a panel to demonstrate B-cell lymphoblastic
lymphoma, since the malignant cells in this condition are often CD43 positive,
and may be difficult to stain with other antibodies. Because it stains granulocytes
and their precursors, it is also an effective marker for myeloid tumours.
PCST: Plasma Cell Screening Tube
Markers:
CD38 identificatie plasmacellen
CD138 It is a specific antigen on multiple myeloma cells
CD45 Leukocyten
CD19 B-cellen
CD56 belangrijke marker voor NK cellen, ook aanwezige op sommige T-cellen
”2 micro Verhoogde expressive bij multiple myeloom en lymfomen
CyIg” cytoplasmatisch immuunglobuline Kappa. Scheiding B-cellen
CyIg” cytoplasmatische immuunglobuline Lambda. Scheiding B-cellen

PCD: Plasma Cell Disorders
Vaak aanwezigheid van klonale plasmacellen in beenmerg die in staat zijn klonale immuunglobuline te produceren die aangetoond kunnen worden in serum of urine. Bekende aandoeningen binnen deze groep zijn de multiple myeloom/kahler en MGUS.
Markers:
CD38 identificatie plasmacellen
CD138 It is a specific antigen on multiple myeloma cells
CD45 Leukocyten
CD19 B-cellen
CD28 Expressed on T cells that provide co-stimulatory signals required for T cell
activation and survival
CD27 buis 2
CD117 Aanwezig op voorlopercellen, stamcellen, beenmerg en thymus.
CD81 Deze marker is aanwezig op hemopotische, endotheel and epitheel cellen. Maar
niet op erythrocyten, thrombocyten en neutrofielen.
Schuingedrukt: backbone-markers
Indeling van het project (deelvragen)
Het doel van mijn project is onderzoeken of zowel normale als pathologische monsters betrouwbaar bepaald kunnen worden met de gevriesdroogde OneFlow buizen op zowel de FACSCanto II als de FACSLyric.
Deelvragen
1. Het valideren van de gevriesdroogde buizen t.o.v. de los gepipetteerde buizen.
2. Het valideren van de nieuwe flowcytometer (FACSLyric) t.o.v. de huidige flowcytometer (FACSCanto II)
Probleemstelling
Gevriesdroogde buizen zijn betrouwbaarder dan de huidig methode waarbij alle monoklonalen los in de buis gepipetteerd worden. Bij het inpipeteren van de buizen is er een grotere kans op fouten. Zoals het pipeteren van de verkeerde antistof in de verkeerde buis of het vergeten te pipeteren van een antistof.
De huidige flowcytometer (FACSCanto II) heeft een panel met 8 kleuren die gelijktijdig getypeerd kunnen worden. Namelijk: FITC, PE, PerCP-Cy’5.5, PE-Cy’7, APC, APC-Cy7, AmCyan, and Pacific Blue’. Ook maakt deze flowcytometer gebruik van FACSDiva software.
De nieuwe flowcytometer (FACSLyric) maakt gebruik van FACSSuite software. Ook kan hij 2 extra kleuren meten. 10 fluorochromen te gelijk. De 2 extra zijn:
Onderzoeksgrenzen
De resultaten worden vergeleken op basis van de klinische data.
Bij screenings buizen wordt er vastgelegd of de uitkomst ‘normaal’ of ‘abnormaal’ is.
Bij de B-CLPD vervolgbuis wordt bepaald of het een ‘typische CLL’ of een ‘andere B-cel populatie’ is. Bij de PCD vervolgbuis wordt bekeken of het een ‘normale’ of ‘abnormale’ plasmacel populatie is.
De mean fluorescence intensity waarden van iedere celmarker worden vastgezet op standaard populaties met behulp van controles. De eisen hiervoor zijn bij een positieve populatie een verschil kleiner dan 30% en bij een negatieve populatie een achtergrond count kleiner dan 1000.Het percentage cellen per subpopulatie wordt vastgelegd en beoordeeld op basis van klinische relevantie.
Om vast te stellen dat de instellingen van de FACSCanto II en FACSLyric gelijk zijn, worden op beide apparaten 3 LST bloed monsters gemeten en vergeleken.
Aan de hand van de klinische verdenking wordt bepaald welk type buis wordt ingezet.
Eerst worden de OneFlow buizen gemeten op de FACSCanto II voor diagnostische doeleinden. Vervolgens worden dezelfde buizen gemeten op de FACSLyric voor dit project. Om het effect van tijd te bepalen zullen buizen soms eerst op de FACSLyric gemeten worden. Sowieso worden alle buizen binnen 1 uur na elkaar gemeten.
Van de PCST, PCD, B-CLPD T1 en ALOT buizen moeten allemaal 20 stuks worden gemeten. Van de LST buizen moeten 50 bloed, 50 beenmerg en 25 overige monsters worden gemeten.
LST maximaal 20 normale samples, BCLPD1 maximaal 75% CLL en ALOT maximaal 3 T-ALL.
Gebruikte technieken

Flowcytometrie:
Tijdens de uitrijping van een pluripotente stamcel tot een werkende immuuncel worden verschillende membraan gebonden en cytoplasmatische eiwitten tot expressie gebracht. De combinatie en sterkte van de expressie van deze eiwitten verschilt per populatie cellen. Er wordt hiervan gebruik gemaakt door specifieke antilichamen tegen deze eiwitten met daaraan een fluorochroom gebonden. Na analyse in een flowcytometer kunnen de leukocyten hierdoor ingedeeld worden op basis van fenotype.

BD biosciences FACSCanto II
Hydrodynamische focussing.
3 laser kanalen:
Golflengte kleur emissielicht Fluorochromen
405/407 nm Violet
488 nm Blauw
633/635 nm Rood

Controles
CST= Cytometer setting & tracking
baseline voor het instellen van de optimale voltage op de PMT van de blauwe laser met behulp van FITC. Fluorescentie blijft constant, voltage varrieerd. Low mid high
8-peak Rainbow bead callibration particles
voor het instellen van de optimale MFI waardes bijeen constante voltage. 7th peak.
voltage gelijk, fluorescentie varieerd.
Compensatie
overspill.

Materiaal en Methode

Voorbewerking materiaal
Leukocyten telling
3x Wassen
(Ficoll / Bulklyses)

Om een monster te kunnen meten op de flowcytometer moet deze vaak eerst ontdaan worden van erytrocyten. Hiervoor worden binnen dit lab 3 methodes gebruikt. Ook kan met 2 van deze methoden leukocyten gepermiabiliseerd worden waardoor er intracellulair gekleurd kan worden.
Methode I: Bulklysis met NH4Cl
NH4Cl trekt water aan waardoor de erytrocyten barsten. 10 minuten op kamertemperatuur v”r de incubatie met antilichamen.

Methode II: Lysis met behulp van FACS Lysing Solution
erytrocyten lyseren in een hypotone milieu en leukocyten permeabiliseren. Na de incubatie met moAbs. Nadeel is dat de morfologie van de leukocyten door de permeabilisatie achteruit gaat.

Methode III: Lysis met behulp van An der Grup FIX&PERM kit
Bestaat uit 2 oplossingen: Oplossing A fixeerd de cellen, oplossing B permeabiliseerd en lyseerd de erytrocyten. Voor intracellulaire aankleuring. Wordt gebruikt bij PCST en PCD.
Voor het meten in een flowcytometer is een celsuspensie nodig met los liggende cellen. Daarom moeten materialen zoals lymfeklieren en biopten eerst over een filter gehaald worden zodat de cellen los in een vloeistof komen.

Inzetten
Incuberen

Wassen
Vaak bevat het materiaal behalve cellulaire antigenen ook nog losse antilichamen. Deze moeten weggewassen worden voor er monoklonale antilichamen toegevoegd worden. Dit kan namelijk zorgen voor een vals positief/negatieve reactie.

Meten

Analyseren

Leerdoelen
– Het leren werken met state-of-the-art flowcytometers
– Het nauwkeurig werken met behulp van SOP’s
– Het profecioneel communiceren met collega’s
– Verslaglegging
– Analyseren van data
Inwerkperiode
Het lezen van protocollen, meehelpen op het lab en het volgen van cursussen van BD en intern.
Tot dat de nieuwe flowcytometer is er zal ik ingewerkt worden op het zelfstandig uitvoeren van de volledige procedure van alle verschillende buizen die ik voor mijn onderzoek moet beoordelen. Hierdoor kan ik als de flowcytometer geleverd en geinstalleerd is meteen aan de slag met het verzamelen van data.

Werkplek omschrijving
Afdeling Immunologie, ook wel Laboratorium Medische Immunologie (LMI) bevindt zich op de 11e en 12e verdieping van het Na en Nb gebouw van het Erasmus MC. De afdeling heeft ongeveer 130 medewerkers die zijn verdeeld over 10 onderzoeksgroepen.
Onderzoeksgroep Leukemie en lymfoom Diagnostiek staat onder leiding van Vincent van der Velden. Binnen deze groep werken 13 mensen.
Tijdplan
Maand Activiteit
Februari inwerken op lab
Maart inwerken op apparaat en schrijven plan van aanpak
April Meten LST OneFlow
Mei Meten B-CLPD T1 en PCST/PCD
Juni analyseren resultaten
Juli Validatie rapport opstellen
Augustus schrijven verslag
September Presentatie, afstudeerzitting, verslag

Kostenberekening

Flowcytometers
Artikel Prijs Aantal Prijs per buis
FACSCanto II
FACS reagentia
Overige kosten
FACSLyric
FACS reagentia
Overige kosten
Totaal

LST met losse MoAb’s
Marker Fluorochroom Prijs/vial Aantal testen Prijs/buis
CD20 PB ‘196,- 200 ‘0,98
CD4 PB ‘228,- 250 ‘0,91
CD45 PO ‘190,- 100 ‘1,90
CD8
IgL
CD56
IgK FITC
FITC
PE
PE Mix
‘600,-
50
‘12,00
CD5 PerCPCy5.5 ‘160,- 66 ‘2,40
CD19 PC7 / PECy7 ‘318,- 200 ‘1,59
TCRGD PC7 / PECy7 ‘305,- 500 ‘0,61
CD3 APC ‘296,- 200 ‘1,48
CD38 APCH7 ‘386,- 166 ‘2,32
Totaal ‘24,19 ex BTW

LST OneTube gevriesdroogd
Artikel Prijs Aantal Prijs per buis
LST OneTube buizen ‘800,- 20 stuks ’40,-

Overig
Artikel Prijs Per Aantal nodig Prijs per buis
BD Lysing solution ‘144,90 100 ml 2 ml ‘0,29
Wasbuffer PBS+Naz ‘1197 1 liter 32 ml ‘0,27
10 ml buizen ‘48,93 1000 stuks 1 stuk ‘0,05
5 ml buizen ‘53,63 1000 stuks 1 stuk ‘0,05
Dopjes
Handschoenen ‘5,35 100 stuks 10 stuks ‘0,53
Loon analist ‘17,50 1 uur 4 uur ’70,-
Totaal ‘71,19

Review this essay:

Name
Rating
Your review: (optional)

Latest reviews:

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *

Time limit is exhausted. Please reload the CAPTCHA.